Biomater.Sci.：负载利拉鲁肽的PLGA/明胶电纺纳米纤维垫通过调节miR-29b-3p促进血管生成，从而加速糖尿病伤口的愈合
DOI:10./D0BMA糖尿病伤口仍然是一项严峻的临床挑战，而当前的疗法在降低高致残率和高发病率方面作用有限。血管生成受损与糖尿病伤口的延迟愈合密切相关，据报道，GLP-1R受体激动剂利拉鲁肽（Lira）可以提高内皮细胞的血管生成能力。然而，由于药物浓度的不可持续性，其应用受到了限制。本研究通过1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS），一种绿色交联接枝集成方法，制备了聚乳酸-乙醇酸/明胶(PLGA/Gel)纳米纤维垫支架，用于皮肤组织工程的利拉鲁肽缓释。利拉鲁肽与PLGA/Gel的结合增加了纳米纤维垫的孔径、亲水性、弹性和降解性能，这有利于伤口愈合。此外，还评估了该材料对糖尿病伤口愈合、血管形成的影响及其潜在机制。结果表明，PLGA/Gel/Lira显著提高了糖尿病真皮伤口的愈合效率，其特点是缩短伤口闭合时间、增加血管密度并提高胶原蛋白的沉积和排列。在体外，Lira逆转了由高葡萄糖（HG）诱导的对内皮细胞增殖、迁移、分化和VEGF分泌的抑制作用。至于潜在机制，Lira特异性降低了miR-29b-3p的水平，靶向AKT/GSK-3β/β-连环蛋白途径以调节内皮细胞的生物学功能。总之，本研究首次将PLGA/Gel与Lira结合使用，以利用它们的协同作用促进血管生成，这是加速糖尿病创面修复的一种有希望的策略。
图1.纳米纤维毡的SEM图像和直径分布。（A）通过SEM获取PLGA、PLGA/凝胶和PLG/凝胶/Lira纳米纤维垫的形态。比例尺=60μm（×）和10μm（×）。（B）由PLGA、PLGA/凝胶和PLGA/凝胶/Lira组成的纳米纤维垫的直径分布。
图2.纳米纤维垫的亲水性测试和FTIR分析。（A）通过水接触角评估纳米纤维垫的亲水性。（B）PLGA、PLGA/Gel和PLGA/Gel/Lira在-波数范围和-波数范围的FTIR光谱曲线。
图3.纳米纤维垫的机械性能。由干燥状态下的PLGA、PLGA/Gel和PLGA/Gel/Lira组成的纳米纤维毡的径向应力-应变曲线、杨氏模量、拉伸强度和屈服伸长率。数据表示为平均值±SEM（n=3）。*P＜0.05
图4.纳米纤维垫的降解和缓释性能。（A）将由PLGA、PLGA/Gel和PLGA/Gel/Lira组成的纳米纤维垫浸入PBS中的剩余质量。（B）PLGA/Gel/Lira纳米纤维垫中Lira的体外释放。
图5.Lira加速了体内伤口愈合。（A）STZ处理的大鼠和伤口全层缺损的手术步骤以及PLGA/Gel、PLGA/Gel/0.5mgLira和PLGA/Gel/1.0mgLira纳米纤维垫的植入示意图。（B）在手术后第0、3、5、7和14天全厚度皮肤缺损的代表性图像。比例尺=10mm。（C）通过伤口的摄影图像量化的伤口闭合率。（D）H＆E染色的代表性图像，以评估第7天和第14天的新上皮总长度。比例尺=2mm。（E）通过H＆E染色定量伤口长度速率。（F）手术后第7天和第14天的Masson三色染色。比例尺=μm（×）和μm（×）。数据表示为平均值±SEM（n=3）。*P＜0.05
图6.Lira改善了糖尿病大鼠的血管生成受损。（A）通过Microfil灌注评估对照组、PLGA/Gel、PLGA/Gel/0.5mgLira和PLGA/Gel/1.0mgLira纳米纤维垫组中的新血管。比例尺=2mm。（B）在第7天和第14天通过Microfil灌注对新血管区域和每个视野的新血管数量进行定量。（C）第7天和第14天用CD31和CD31/α-SMA染色血管的免疫组织化学和免疫荧光评估（红色箭头代表血管）。比例尺=μm。（D）在第7天和第14天每个视野的血管数量的量化。数据表示为平均值±SEM（n=3）。*P＜0.05
图7.Lira通过HUVEC促进增殖、迁移、管形成和VEGF分泌。（A）在第1、3和7天用不同处理孵育的HUVEC的增殖。（B）HUVEC的迁移和管形成的代表性图像。比例尺=μm。（C）HUVEC中细胞迁移的定量。（D）HUVEC中管形成的定量。（E）通过Elisa评估由HUVEC释放的细胞上清液的VEGF浓度。（F）HUVEC的免疫荧光评估VEGF分泌的能力。细胞骨架、细胞核和VEGF分别染成红色、蓝色和绿色。比例尺=μm。数据表示为平均值±SEM（n=3-6）。*P＜0.05。
图8.过表达miR-29b-3p在体外抑制了Lira促血管生成。（A）LG、HG和HG+Lira处理后HUVEC中miRNA的相对表达。（B）用HG+阴性对照模拟物（ncm），HG+Lira+ncm和HG+Lira+miR-29b-3p模拟物（Lira+29bm）处理的HUVEC中miR-29b-3p的相对表达。（C）与HG+ncm、HG+Lira+ncm和HG+Lira+29bm共孵育的HUVEC的增殖。（D-F）代表性图像以及管形成和迁移的量化。比例尺=μm。（G）用HG+ncm、HG+Lira+ncm和HG+Lira+29bm处理的HUVEC细胞上清液的VEGF浓度。数据表示为平均值±SEM（n=3-6）。*P＜0.05
图9.AKT/GSK-3β/β-catenin途径在HUVEC中miR-29b-3p介导的Lira促血管生成能力方面起着重要作用。（A）通过TargetScan、miRandamiRTarbase和PicTar数据库预测MiR-29b-3p目标。（B）通过交叉miR-29b-3p的可能靶标和与内皮细胞增殖和迁移有关的GO来调节靶标筛选的内皮细胞。（C）通过荧光素酶报告直接抑制miR-29b-3p对AKT的作用。（D）用LG、HG、HG+50nMLira、HG+50nMLira+XAV-（HG+Lira+XAV）和HG+50nMLira+LY292（HG+Lira+LY）处理，通过免疫印迹法检测HUVEC的GSK-3β和AKT磷酸化水平以及β-连环蛋白的相对表达水平。（E）在第1、3和7天，HUVEC的增殖。（F-H）HUVEC的迁移和管形成的图像和定量分析。比例尺=μm。（F）用LG、HG、HG+Lira、HG+Lira+XAV和HG+Lira+LY处理的HUVEC细胞上清液的VEGF浓度。数据表示为平均值±SEM（n=3-6）。*P＜0.05。
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